Hintergrund

Plasmide können in verschiedenen Formen (Topologien) vorliegen. Intakte Plasmide liegen in einer geschlossenen, kovalenten und zirkulären Form (ccc-Form, covalently closed circular) vor, die negativ superspiralisiert ist.

Für einen effizienten Gentransfer sowohl in vitro als auch in vivo ist der Anteil an den ccc-Formen in einer Plasmidpräparation besonders wichtig. Aufgrund ihrer kompakteren Form gelangen ccc-Formen gegenüber oc-Formen besser in die Zelle.

Durch Einzelstrangbrüche, die enzymatisch oder durch mechanische Beanspruchung der DNA entstehen können, kommt es zu einer Entspannung des Moleküls. Die resultierende Form wird als offen zirkulär (oc-Form, open circular) bezeichnet. Restriktionsendonukleasen schneiden DNA an bestimmten Stellen, so entstehen lineare DNA-Moleküle. Durch Fehler bei der Replikation oder durch homologe Replikation können auch multimere Formen der Plasmide entstehen. Diese Multimere sind kovalent verbundene Aneinanderreihungen von zwei oder mehreren Monomeren, so genannte Konkatemere. Somit können in der Bakterienzelle neben den Monomeren auch ccc- und oc-Formen der Dimere oder sogar weitere Multimere existieren.

Die verschiedenen Topologien in einer Plasmidpräparation können durch Agarosegelelektrophorese und anschließender Färbung mit fluoreszierenden Farbstoffen sichtbar gemacht werden. Die Zuordnung der Banden zu den Plasmidformen ist mit einigen Schwierigkeiten verbunden, da sich die elektrophoretische Beweglichkeit von Plasmiden mit unterschiedlicher Struktur mit den Betriebsbedingungen während der Elektrophorese ändert. Allgemein lässt sich jedoch sagen, dass Plasmide der ccc-Form am schnellsten wandern. Danach folgen die oc-Monomer-Form und ccc-Dimer-Form. Jedoch ist die genaue Auftrennung der ccc-Dimer-Form und der oc-Monomer-Form im Allgemeinen nur bei kleinen Plasmiden zu erkennen.

Hier ist die Analyse mit Hilfe der CGE die einzige verlässliche Methode zur Bestimmung der Plasmidtopologien in einer Plasmidpräparation.